一说到基因编辑，你可能会想到其犹如“剪刀”般的简易高效，但其脱靶效应同样不容忽视。一旦脱靶，其有可能影响细胞正常功能，甚至致癌。尽管目前已有多种检测脱靶的方法，但都不能高灵敏地检测到脱靶，尤其是单核苷酸突变。

中国科学院神经科学研究所（中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心）、上海脑科学与类脑研究中心杨辉研究组与中国科学院上海营养与健康研究所隶属的计算生物学研究所（中国科学院-马普学会计算生物学伙伴研究所）李亦学研究组等合作者，建立了一种新型脱靶检测技术。他们发现，设计良好的CRISPR/Cas9并没有明显的脱靶效应，这个结果结束了之前对于CRISPR/Cas9脱靶率的争议。与此同时，他们在世界上首次证实一直以来被认为更加安全的单碱基编辑技术有可能导致大量无法预测的脱靶，存在严重的安全风险。此研究显著提高了基因编辑技术脱靶检测的敏感性，能够发现之前的脱靶检测手段无法发现的完全随机的脱靶位点，为基因编辑工具的安全性评估带来了突破性的新工具，有望成为新的行业检测标准。

相关研究成果北京时间2019年3月1日发表在国际权威学术期刊《科学》上。

现有的脱靶检测手段，不适用第四代基因编辑技术

所谓基因编辑，就是对基因组中的特定DNA片段进行敲除、加入、替换等。人类基因组含有约31.6亿个DNA碱基对，CRISPR/Cas9作为第三代基因编辑工具，可以从31.6亿个碱基对中剪除一两个，效率非常高，因此在备受期待的同时，其脱靶风险也一直备受关注。不过犹如射箭，想知道是否“中靶”不难，难的是不知道脱靶到哪里去了。

DNA是个双链螺旋结构，使用CRISPR/Cas9技术，会造成DNA断裂，这对机体本身其实很危险，它可能导致染色体丢失、异位，容易发生癌症。有没有比CRISPR/Cas9更安全的技术呢？袖子坏了，用不着把袖子都剪掉，可以缝补一下。因此，CRISPR/Cas9技术后来又衍生出了第四代基因编辑技术BE3（单碱基编辑）。“如果把CRISPR比作一辆车，它到了目的地，原来是由Cas9来切断DNA，而BE3则是跟着这辆车到了特定位置后，直接对碱基进行修改，不会剪断DNA。”杨辉告诉解放日报·上观新闻记者，现有的脱靶检测手段依赖于DNA断裂的产生，因此并不适用于单碱基编辑。

杨辉。中国科学院科技摄影联盟摄

聊了一个多小时，就设计出了实验

“我和当时在所里做博士后的左二伟，关在实验室里聊了一个多小时，就设计出了这个实验。”1985年出生的杨辉研究员，在28岁时就成为了神经所最年轻的课题组长。杨辉课题组与合作者建立了一种被命名为“GOTI”的脱靶检测技术。他们在小鼠受精卵分裂到两个细胞的时候，编辑了其中一个，并在DNA上标记了红色荧光蛋白，这些标记也会携带在子代细胞里。在小鼠胚胎发育到14.5天时，利用流式细胞分选技术，分选出被编辑过的细胞和没有被编辑过的细胞，再进行全基因组测序比较两组差异。

“传统的检测方法比较粗暴，采用高通量测序，往往会造成实验组和对照组都有三千多个单碱基突变，真正的差异就很难辨别，而使用我们的技术只发现了14个单碱基突变，差异一下就看出来了，第一次非常清楚地把脱靶信号分离出来。”杨辉说。由于实验组和对照组来自同一枚受精卵，理论上基因背景完全一致，因此直接比对两组细胞的基因组，其差异基本就可以认为是基因编辑工具造成的。这也正是这一研究最精妙的地方，多位审稿人不约而同用了“精美”一词来形容实验的设计。

借助于GOTI系统，研究人员先检测了CRISPR/Cas9系统。结果发现，设计良好的CRISPR/Cas9并没有明显的脱靶效应，这个结果结束了之前对于CRISPR/Cas9脱靶率的争议。

“最让我们震惊的是，以BE3为代表的单碱基编辑脱靶率竟然这么高，比自然突变高出了20倍之多。”杨辉说，BE3因为不产生DNA双链断裂，一直以来被认为更安全，也从未发现过明显的脱靶问题。然而，这次研究发现，BE3存在非常严重的脱靶，而且大多出现在传统脱靶预测认为不太可能出现脱靶的位点，部分脱靶位点甚至出现在了抑癌基因上，因此BE3有着很大的安全隐患，目前不适合作为临床技术。

从脱靶问题入手，改进基因编辑工具

“基因编辑工具开发及安全性评价，是基因治疗的基础。”中科院神经所所长蒲慕明院士说，基因编辑安全性问题非常重要，一旦脱靶，除了会造成基因变异，还会影响非基因的DNA片段发生变化。此次工作显著提高了基因编辑技术脱靶检测的敏感性，让脱靶无处隐藏，其在精度、广度和准确性上都远超之前的基因编辑脱靶检测技术。在世界上首次证实了以BE3为代表的单碱基编辑存在之前技术无法检测的脱靶风险，让世人重新审视了这一新兴技术的风险。

“让人感到欣慰的是，美国有家公司本来紧锣密鼓打算用BE3技术开展地中海贫血的临床实验，听说我们的研究成果后，已经暂停了。”杨辉介绍，现有的7千余种罕见病，80%是单碱基突变导致的，全球共有3亿病人。BE3技术给这些病人带来了希望，比如杜氏肌营养不良患者往往行走困难，在患者体细胞上进行基因编辑后，这一症状得到了改善。预计2022年有40种基因治疗新药上市。

尽管存在脱靶问题，但单碱基编辑技术本身有着巨大的价值。杨辉透露，接下来，他们主要做两件事，一是进一步检测，看看除了会导致异常的基因突变是否还有其他问题；二是从脱靶问题入手，设法改进这个基因编辑工具，尝试建立一种不会脱靶、也没有其它风险的单碱基编辑技术。“基因编辑工具的专利都在国外，我们希望能打破国际垄断，开发出精度更高、安全性更大的新一代基因编辑工具，建立行业的新标准。”